Полезные ресурсы:
1. Периодические лихорадки - https://periodicfever.ru/useful-resources/
По всем вопросам связанных с диагностикой обращайтесь в Медико-генетический научный центр РАМН
Адрес: 115478, Москва, Москворечье ул., д. 1
Телефон: +7 (499) 324-87-72 (регистратура), +7 (499) 324-20-04 (лаборатория наследственных болезней обмена веществ)
Электронная почта:Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.
Общие принципы лабораторной диагностики наследственных болезней обмена веществ
На клиническом уровне диагноз НБО может быть только заподозрен, и дальнейшая диагностика целиком зависит от применения необычайно широкого спектра биохимических и молекулярно-генетических методов. В большинстве случаев только сочетанная интерпретация всех полученных результатов дает возможность точно определить форму заболевания.
Стратегия достоверной диагностики НБО включает несколько этапов:
- Выявление дефектного звена метаболического пути посредством анализа (количественного, полуколичественного или качественного) соответствующих метаболитов
- Выявление дисфункции белка посредством оценки его количества и/или активности
- Выяснение природы мутации, т.е. характеристика мутантного аллеля на уровне гена
Такая стратегия используется не только для решения научных проблем, касающихся изучения нормального метаболизма, молекулярных механизмов патогенеза НБО, выявления гено-фенотипических корреляций, она необходима прежде всего для практической диагностики НБО. Верифицировать диагноз на уровне белка и мутантного гена необходимо как для проведения пренатальной диагностики, медико-генетического консультирования отягощенных семей, так и в ряде случаев для назначения адекватной терапии. Например, при недостаточности дигидроптеридинредуктазы клинический фенотип и уровни фенилаланина будут неотличимы от классической формы ФКУ, но подходы к терапии этих заболеваний принципиально отличаются. Важность локусной дифференциации НБО для медико-генетического консультирования может быть продемонстрирована на примере мукополисахаридоза II типа (болезнь Хантера). По спектру экскретируемых гликозаминогликанов невозможно дифференцировать между собой мукополисахаридозы II, I и VII типов, но из этих заболеваний только болезнь Хантера наследуется по Х-сцепленному рецессивному типу, что имеет принципиальное значение для прогноза потомства в отягощенной семье. Безусловна приоритетность молекулярно-генетических методов при установлении гетерозиготного носительства, а также в пренатальной диагностике заболеваний, при которых мутантный фермент не экспрессируется в клетках ворсин хориона.
Этап исследования метаболитов
Оценка метаболитов в биологических жидкостях — необходимый этап диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий, мукополисахаридозов, митохондриальных и пероксисомных болезней, дефектов метаболизма пуринов и пиримидинов и т.д. Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в диагностике НБО. Это обусловлено тем, что современный арсенал хроматографических технологий чрезвычайно широк и позволяет эффективно и информативно разделять сложные многокомпонентные смеси, к которым в том числе относится и биологический материал. Для селективного скрининга НБО успешно используется тонкослойная хроматография, позволяющая получать информацию на качественном уровне. Этот метод хроматографии применим для разделения аминокислот, пуринов и пиримидинов, углеводов, олигосахаридов. Для количественного анализа маркеров-метаболитов НБО успешно применяются такие хроматографические методы как газовая и высокоэффективная жидкостная хроматографии, а также хроматомасс-спектрометрия (ГХ, ВЭЖХ и ХМС соответственно). ГХ и ВЭЖХ являются универсальными методами разделения сложных смесей соединений, отличаются высокой чувствительностью и воспроизводимостью. В обоих случаях разделение осуществляется в результате различного взаимодействия компонентов смеси с неподвижной и подвижной фазами хроматографической колонки. Для ГХ подвижной фазой является газ-носитель, для ВЭЖХ — жидкость (элюент). Выход каждого соединения фиксируется детектором прибора, сигнал которого преобразуется в пики на хроматограмме. Каждый пик характеризуется временем удерживания и площадью. Следует отметить, что ГХ проводится, как правило, при высокотемпературном режиме, поэтому ограничением для ее применения является термическая неустойчивость соединений. Для ВЭЖХ не существует подобных ограничений, т.к. в этом случае анализ проводится в мягких условиях. ХМС представляет собой комбинированную систему ГХ или ВЭЖХ с масс-селективным детектором, что позволяет получать не только количественную, но и качественную информацию, т.е. дополнительно определяется структура соединений в анализируемой смеси.
Одним из перспективных направлений в развитии программ диагностики НБО является применение методов, позволяющих количественно определять множество метаболитов, являющихся маркерами разных групп НБО. К таким методам относится тандемная масс-спектрометрия (ТМС). ТМС позволяет охарактеризовать структуру, молекулярную массу и провести количественную оценку 3000 соединений одновременно. При этом не требуется длительной подготовки проб для проведения анализа (как, например, для ГХ), а время исследования занимает несколько секунд.
Этап исследования мутантных белков
Исследование мутантных белков может проводиться с помощью различных методов:
- Определение активности фермента с применением естественных субстратов
- Определение активности фермента с использованием искусственных субстратов
- Нагрузка культивируемых фибробластов накапливаемыми субстратами
- Измерение концентрации белка с помощью иммунохимических методов
Материалом для измерения активности ферментов при НБО являются прежде всего лейкоциты периферической крови: практически при всех лизосомных болезнях накопления, метилмалоновой ацидурии, некоторых гликогенозах. Для диагностики GM2-ганглиозидозов, недостаточности биотинидазы используют плазму или сыворотку крови. В некоторых случаях объектами исследования являются мышечная или печеночная ткань: ферменты дыхательной цепи митохондрий, гликогенозы. Также широко используется для диагностики культура кожных фибробластов.
Этап исследования мутантных генов
Развитие методов молекулярной биологии явилось настоящей революцией в области клинической биохимии. Разработка стандартных протоколов молекулярных исследований и автоматизация используемых методов являются сегодня законченным комплексом диагностических подходов и становятся наряду с биохимическими методами рутинной процедурой в клинических лабораториях. Быстрое развитие исследований в области расшифровки генома человека и определение ДНК- последовательности генов делает сейчас возможным ДНК-диагностику различных наследственных заболеваний. Методы ДНК-диагностики и анализа структуры нормальных генов и их мутантных аналогов при наследственных болезнях обмена начали использоваться в течение последнего десятилетия.
Для ДНК-диагностики наследственных заболеваний используются два основных подхода — прямая и косвенная ДНК-диагностика. Прямая ДНК-диагностика представляет собой исследование первичной структуры поврежденного гена и выделение мутаций, ведущих к заболеванию. Для детекции молекулярных повреждений в генах, обуславливающих наследственные болезни, используется стандартный арсенал методов молекулярной биологии. В зависимости от характеристики и типов мутаций, частот их встречаемости при различных наследственных заболеваниях, те или иные методы являются наиболее предпочтительными.
Для диагностики НБО в тех случаях, когда биохимический дефект точно известен, легко и достоверно определяем с использованием биохимических методик, ДНК-методы вряд ли займут приоритетное место. В этих случаях применение ДНК-анализа является скорее научно-исследовательским, а не диагностическим подходом. Однако после точно установленного диагноза методы ДНК-анализа будут полезны для последующей пренатальной диагностики, идентификации гетерозиготных носителей в семье и прогноза заболевания у гомозигот, а также для отбора больных с целью проведения казуальной терапии в будущем (фермент-заместительной и генотерапии). Также в случаях, когда биохимический дефект точно не известен, биохимическая диагностика затруднена, недостаточно достоверна или требует инвазивных методов исследования, методы ДНК-диагностики являются единственными и незаменимыми для точной постановки диагноза.
В общем виде тактика проведения диагностики НБО в каждом конкретном случае должна планироваться совместно с врачом-биохимиком и врачом-генетиком. Необходимыми условиями успешной и быстрой диагностики является понимание этиологии, механизмов патогенеза заболевания, знание специфических биохимических маркеров.